Differenza tra PCR e sequenziamento del DNA

Differenza chiave - PCR vs sequenziamento del DNA
 

La PCR e il sequenziamento del DNA sono due importanti tecniche in Biologia Molecolare. Polymerase Chain Reaction (PCR) è il processo che crea un gran numero di copie di un frammento di DNA. Il sequenziamento del DNA è la tecnica che risulta nell'ordine preciso dei nucleotidi di un dato frammento di DNA. Questa è la differenza chiave tra PCR e sequenziamento del DNA. La PCR è uno dei principali passaggi coinvolti nel sequenziamento del DNA.

CONTENUTO
1. Panoramica e differenza chiave
2. Cos'è la PCR
3. Cos'è il sequenziamento del DNA
4. Confronto affiancato - PCR vs Sequenziamento del DNA
5. Sommario

Cos'è la PCR?

Polymerase Chain Reaction (PCR) è una tecnica di amplificazione del DNA utilizzata in Biologia Molecolare. Produce da migliaia a milioni di copie di un particolare frammento di DNA. Questo metodo è stato sviluppato da Kary Mullis nel 1983. In questa tecnica, il frammento del DNA da amplificare serve come modello e l'enzima DNA polimerasi aggiunge nucleotidi complementari al primer che è disponibile nella miscela PCR. Alla fine della reazione PCR, vengono sintetizzate molte copie del DNA campione.

Ci sono diversi componenti della miscela PCR, tra cui DNA, DNA polimerasi (Taq polimerasi), primer (primer forward e reverse), nucleotidi (blocchi costitutivi del DNA) e un buffer. La PCR avviene all'interno di una macchina per PCR e la miscela PCR corretta deve essere caricata nella macchina e deve essere avviato il programma corretto. Questa tecnica consente la produzione di migliaia e milioni di copie di una particolare sezione di DNA da una quantità molto piccola di DNA.

Le reazioni di PCR si verificano in modo ciclico per produrre la quantità visibile di prodotti di PCR su un gel. Ci sono tre fasi principali coinvolte in una reazione di PCR, vale a dire denaturazione, ricottura di primer e estensione del filamento come mostrato nella Figura 01. Questi tre passaggi si verificano a tre diverse temperature. Il DNA esiste in una forma a doppio filamento mediante legami a idrogeno tra le basi complementari. Prima dell'implicazione, il DNA a doppio filamento deve essere separato l'uno dall'altro. È fatto dando una temperatura elevata. A temperatura elevata, il DNA a doppio filamento si denatura in singoli filamenti. Quindi i primer dovrebbero avvicinarsi alle estremità fiancheggianti del frammento specifico o del gene del DNA. Il primer è un breve frammento di DNA a filamento singolo complementare alla sequenza bersaglio. I primer diretti e inversi si ricoprono con le basi complementari alle estremità fiancheggianti del DNA del campione denaturato alla temperatura di ricottura. I primer dovrebbero essere resistenti al calore. Una volta che i primer si ricoprono con il DNA del campione, l'enzima taq polimerasi avvia la sintesi dei nuovi filamenti aggiungendo nucleotidi che sono complementari al DNA bersaglio. Taq polimerasi è un enzima stabile al calore isolato da un batterio termofilo chiamato Thermus aquaticus. Il buffer PCR mantiene le condizioni ottimali per l'azione della taq polimerasi. Queste tre fasi delle reazioni di PCR vengono ripetute per produrre la quantità richiesta di prodotto di PCR. Dopo ogni reazione PCR, il numero della copia del DNA è raddoppiato. Quindi, un'amplificazione esponenziale può essere osservata in PCR. I prodotti della PCR possono essere osservati mediante elettroforesi su gel e possono essere purificati per ulteriori studi.

Figura 01: passaggi principali di una reazione PCR

La PCR è uno strumento prezioso nella ricerca medica e biologica. La PCR ha un valore speciale nella scienza forense poiché può amplificare il DNA per gli studi dai piccoli campioni dei criminali e creare profili di DNA forense. La PCR è ampiamente utilizzata in molte aree della biologia molecolare, tra cui la genotipizzazione, la clonazione di geni, il rilevamento di mutazioni, il sequenziamento del DNA, i test su microarray di DNA e test di paternità, ecc..

Figura 02: reazione a catena della polimerasi

Cos'è il sequenziamento del DNA?

Il sequenziamento del DNA è la determinazione di un ordine preciso dei nucleotidi - adenina, guanina, citosina e timina in un dato frammento di DNA. Le informazioni genetiche sono memorizzate nelle sequenze di DNA usando l'ordine corretto dei nucleotidi. Quindi, trovare l'ordine preciso dei nucleotidi in un frammento di DNA è molto importante per conoscere la struttura e la funzione dei geni.

Il protocollo di sequenziamento del DNA coinvolge diversi processi. Il primo passo è l'isolamento del DNA interessato o del DNA genomico di un organismo. Usando la PCR (come descritto sopra), la regione desiderata del DNA dovrebbe essere amplificata. Il prodotto amplificato per PCR deve essere separato dall'elettroforesi su gel e purificato. I frammenti amplificati sono serviti come modelli per il sequenziamento. Il sequenziamento può essere eseguito seguendo il sequenziamento Sanger o il metodo di sequenziamento ad alto throughput. Il sequenziamento di Sanger richiede l'elettroforesi capillare dei risultanti frammenti di DNA. La determinazione del corretto ordine nucleotidico può essere effettuata mediante la lettura manuale degli autoradiografi o utilizzando sequenziatori automatici di DNA.

Il sequenziamento genico ha contribuito al progetto del genoma umano e facilitato la mappatura del genoma umano nel 2003. In ambito forense, il sequenziamento del DNA ha consentito l'identificazione di individui che mostrano sequenze di DNA uniche e identificano i criminali. In medicina, il sequenziamento del DNA può essere utilizzato per rilevare i geni responsabili delle malattie genetiche e di altro tipo, trovare i geni dei difetti e sostituirli con i geni corretti. In agricoltura, le informazioni sul sequenziamento del DNA di alcuni microrganismi vengono utilizzate per produrre colture transgeniche con caratteristiche economicamente desiderate.

Figura 03: Sequenziamento del DNA

Qual è la differenza tra PCR e sequenziamento del DNA?

PCR vs Sequenziamento del DNA
Il processo PCR crea da migliaia a milioni di copie del frammento di DNA interessato.	Il sequenziamento del DNA è il processo per determinare l'ordine preciso dei nucleotidi in un dato frammento di DNA.
Risultato
La PCR crea da migliaia a milioni di copie di un particolare frammento di DNA	Ciò comporta l'ordine corretto delle basi in un particolare frammento di DNA.
Coinvolgimento di ddNTPs
PCR non richiede ddNTPs. Usa dNTPs.	Il sequenziamento del DNA richiede che ddNTPs interrompa la formazione di filamenti.

Riepilogo: PCR vs sequenziamento del DNA

La PCR e il sequenziamento del DNA sono strumenti molto importanti in molte aree della biologia molecolare. L'amplificazione dei frammenti di DNA viene effettuata mediante la tecnica PCR mentre l'ordine corretto dei nucleotidi di un frammento di DNA è determinato dal sequenziamento del DNA. Questa è la differenza tra PCR e sequenziamento del DNA.

Riferimento:
1. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n. Web. 21 febbraio 2017.
2. Shendure, Jay e Hanlee Ji. "Sequenziamento del DNA di nuova generazione." Nature News. Nature Publishing Group, 09 ottobre 2008. Web. 21 febbraio 2017

Cortesia dell'immagine:
1. "Passi PCR" di Tinojasontran - Opera propria (dominio pubblico) tramite Commons Wikimedia
2. "Polymerase chain reaction" di Enzoklop - Opera propria (CC BY-SA 3.0) attraverso Commons Wikimedia
3. "Sequenza del DNA" di Sjef - Opera propria (dominio pubblico) via Commons Wikimedia